Orlando est une biographie fictive d’une personne appelée Orlando qui vit plus de trois cents ans depuis le règne de la reine Elizabeth au XVIe siècle jusqu’au règne du roi Edwards en 1928, l’année où Virginia Woolf a écrit le roman. Au début du livre, Orlando est un noble qui a des ambitions littéraires. En tant qu’homme, il écrit des pièces de théâtre et des poèmes chaque jour de sa vie tout en courtisant certaines des plus belles femmes de sa génération. Tout change lorsqu’il se transforme en femme, et pour le reste, Woolf établit des comparaisons entre les processus de pensée des hommes et des femmes à travers les différentes époques.
Dans le premier chapitre, Orlando est un garçon de quinze ans vivant avec ses parents. Il rêve de rejoindre son père et son grand-père dans la guerre contre les Maures, mais la reine Elizabeth, séduite par sa beauté exceptionnelle, refuse de lui permettre de se battre. Cependant, il tombe en disgrâce auprès de la reine lorsqu’elle le surprend en train d’embrasser une autre fille. Peu de temps après, le roi Jacques reprend le trône et accueille à nouveau Orlando à la cour royale. À ce moment-là, la Grande Gelée s’est emparée du pays. Pour accroître sa popularité, le roi s’appuie sur la glace, créant une atmosphère de type carnaval. En patinant, Orlando rencontre une fille russe appelée Sasha. Leur relation fait scandale, mais Orlando est profondément amoureux d’elle. Malheureusement, lors d’une des humeurs mélancoliques d’Orlando, Sasha le trompe. Il lui pardonne, mais peu de temps après, elle retourne en Russie.
Dans le deuxième chapitre, le chagrin envahit Orlando et il retourne dans sa maison de campagne et dort pendant sept jours. À son réveil, il se souvient peu de Sasha, même s’il sombre dans la dépression si quelqu’un mentionne la Russie. Pour se remettre de son humeur, il se remet à lire et à écrire. Après une longue période d’isolement, il organise une rencontre avec un célèbre poète nommé Nick Greene. Greene vient chez lui et divertit tout le monde avec des histoires sur Shakespeare et Marlowe, et Orlando lui montre certaines de ses propres œuvres. Greene promet de le lire une fois rentré chez lui. Lorsqu’il rentre chez lui, Greene décide d’écrire un article satirique sur Orlando, en utilisant une partie de l’extrait du poème d’Orlando. Orlando est tellement bouleversé lorsqu’il lit le livre qu’il dénonce tous les hommes et les remplace par des chiens. Finalement, Orlando sort de son humeur et décide qu’il devrait écrire sur tout ce qui lui plaît. Il décide que la meilleure chose à écrire est son environnement et sa maison. C’est en écrivant qu’il se rend compte que son domaine a besoin d’être redécoré et qu’il entreprend de le rendre à nouveau beau. Les gens viennent de loin pour voir les nouveaux développements et Orlando fait partie de la haute société. Un jour, il rencontre une archiduchesse et tombe amoureux. Ce sentiment le choque et il demande au roi Charles de le nommer ambassadeur de Constantinople en Turquie.
Le chapitre trois suit l’époque d’Orlando en tant qu’ambassadeur de Constantinople. Sa beauté signifie qu’il est populaire auprès de tout le monde et particulièrement des femmes. Orlando, cependant, n’entretient aucune relation étroite et se concentre sur son travail. Un tel dévouement impressionne le roi et il envoie un ami pour décerner à Orlando la position la plus élevée de sa pairie. Des célébrations suivent la cérémonie, mais Orlando disparaît dans sa chambre. Le matin, il ne se réveille pas et reste endormi pendant sept jours. Pendant ce temps, les Turcs se soulèvent contre le sultan et entrent dans la chambre d’Orlando, avec l’intention de le tuer. En voyant Orlando profondément endormi, ils pensent qu’il est déjà mort. Quand Orlando se réveille, il s’est transformé en femme. Elle part avec un Gitan et rejoint leur mode de vie. Malheureusement, la différence de style de vie est trop grande et elle paie le retour en Angleterre.
Le chapitre quatre détaille le temps passé par Orlando à bord du navire et ses difficultés à accepter sa nouvelle identité de femme. Immédiatement, il réalise le pouvoir que les femmes peuvent exercer sur les hommes lorsque le capitaine lui offre son propre auvent. La relation avec le capitaine se développe et il l’invite à terre alors qu’ils jettent l’ancre en Italie. A son retour au bateau, elle se sent enfin comme une vraie femme. Bientôt, ils reviennent en Angleterre. Orlando retourne chez elle à Blackfriars et découvre qu’elle a des problèmes juridiques en raison de son changement de sexe et de trois hommes prétendant être ses fils, ayant donc un droit légal sur sa propriété. Elle décide de retourner au pays. Ici, elle rencontre à nouveau l’archiduchesse. Étrangement, lorsqu’elle invite l’archiduchesse chez elle, il s’avère que c’est un homme. L’archiduc veut épouser Orlando, mais elle n’a aucun sentiment pour lui. Elle parvient à se débarrasser de lui en disparaissant dans la vie mondaine et en retrouvant de nombreux admirateurs masculins, dont le poète M. Pope. Elle s’ennuie vite de leur compagnie et commence à se déguiser en homme et à se promener dans Londres. A la fin du chapitre, la ville s’assombrit et le XVIIIe siècle devient le XIXe siècle.
Dans le cinquième chapitre, Orlando lutte pour faire face à l’époque victorienne. Partout où elle regarde, les gens sont mariés et les femmes ont de nombreux enfants. Elle sait que la société attend la même chose d’elle et elle se sent déchirée par son désir d’indépendance et par le besoin de se conformer. Un jour, elle se promène dans le parc et rencontre les marins Shelverdine. Immédiatement, ils décident de se marier. Orlando l’aime et encore plus lorsqu’elle découvre qu’il était une femme. Ils passent chaque journée ensemble jusqu’à ce que Shelverdine reprenne la mer. Avant son départ, un serviteur d’Orlando les épouse.
Dans le sixième chapitre, Orlando veut redevenir écrivain. Elle a une rencontre fortuite avec Nick Greene. Greene a l’air complètement différent, mais Orlando découvre bientôt que ses points de vue sur la vie sont similaires à ceux d’avant, car il prétend détester les poètes victoriens modernes, mais aime les poètes élisabéthains qu’il méprisait autrefois. Orlando lui montre son poème, The Oak Tree, et Greene promet de trouver un éditeur et d’obtenir de bonnes critiques. Orlando se rend ensuite dans une librairie et achète toute la littérature victorienne disponible. Lorsqu’elle a fini de lire, elle a un enfant et la période passe à 1928. Désormais dans le présent, elle réfléchit aux temps anciens et pense même revoir sa vieille flamme russe, Sasha. De telles pensées lui font peur et elle retourne attendre le retour de son mari. Le livre se termine par la réunion de Shelverdine et Orlando.