Thurber avait deux frères, William et Robert. Une fois, alors qu’il jouait à un jeu de Guillaume Tell, son frère William a tiré une flèche sur James dans l’œil. En raison du manque de technologie médicale, Thurber a perdu un œil. Cette blessure le rendrait plus tard presque entièrement aveugle. Pendant son enfance, il n’a pas pu participer à des sports et à des activités à cause de sa blessure et a plutôt développé une imagination créatrice, qu’il a partagée dans ses écrits.
De 1913 à 1918, Thurber a fréquenté l’Ohio State University, où il était membre de la fraternité Phi Kappa Psi. Il n’a jamais obtenu son diplôme de l’Université parce que sa mauvaise vue l’a empêché de suivre un cours obligatoire du ROTC. En 1995, il obtient un diplôme à titre posthume.
De 1918 à 1920, à la fin de la Première Guerre mondiale, Thurber a travaillé comme commis au code pour le département d’État, d’abord à Washington, DC, puis à l’ambassade américaine à Paris, en France. Après cela, Thurber est retourné à Columbus, où il a commencé sa carrière d’écrivain en tant que journaliste pour le Columbus Dispatch de 1921 à 1924. Pendant une partie de cette période, il a passé en revue des livres, des films et des pièces de théâtre actuels dans une chronique hebdomadaire intitulée « Credos and Curios, » un titre qui sera plus tard donné à un recueil posthume de son œuvre. Thurber est également revenu à Paris au cours de cette période, où il a écrit pour le Chicago Tribune et d’autres journaux.
En 1925, il s’installe à Greenwich Village à New York, obtenant un emploi de journaliste pour le New York Evening Post. Il rejoint l’équipe du New Yorker en 1927 en tant que rédacteur en chef avec l’aide de son ami et collaborateur du New Yorker, EB White. Sa carrière de dessinateur a commencé en 1930 lorsque White a trouvé certains des dessins de Thurber dans une poubelle et les a soumis pour publication. Thurber contribuera à la fois ses écrits et ses dessins au New Yorker jusque dans les années 1950.
Thurber a été marié deux fois. En 1922, Thurber épousa Althea Adams. Le mariage fut troublé et se termina par un divorce en mai 1935. Adams donna à Thurber son unique enfant, sa fille Rosemary. Thurber s’est remarié en juin 1935 avec Helen Wismer. Son deuxième mariage a duré jusqu’à sa mort en 1961, à l’âge de 66 ans, en raison de complications d’une pneumonie, qui a suivi un accident vasculaire cérébral subi à son domicile. Ses derniers mots, mis à part le mot répété « Dieu », étaient « Dieu bénisse… Dieu maudit », selon Helen Thurber.